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Estrategia de control biológico de Fusarium en maíz

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Este proyecto se realizó con la finalidad de abrir la posibilidad del  uso de la colección de microorganismos como una nueva herramienta para el monitoreo de antagonistas a otros patógenos del cultivo de maíz y de otros cultivos de importancia comercial para Sinaloa. En esta segunda parte trataremos la obtención de la colección de microorganismos del suelo de maíz.

Se realizó el muestreo de 50 muestras de suelos asociados a raíz (50 plantas muestreadas) en cinco parcelas para conformar 10 muestras compuestas, cinco de estas muestras compuestas corresponden a plantas sanas y las otras cinco muestras compuestas corresponden a la condición enferma, o con indicios de daño por la presencia de Fusarium. Con estas muestras se elaboraron 10 sub-bancos (cinco enfermos y cinco sanos) y de cada uno se tomaron mil 152 microorganismos del suelo para elaborar el banco de microorganismos que estará conformado por 11 mil 520 microorganismos procariotas aislados y purificados a partir de unidades formadoras de colonias.

Se tomaron en total 10 muestras (plantas) de cada parcela muestreada. Las muestras se tomaron en los puntos del lote donde se observaron plantas sintomáticas y asintomáticas. Con la ayuda de una pala se obtuvieron de 3 a 4 kilogramos de suelo adherido a la raíz y tallo principal de la planta de maíz. Del total de cada muestra de suelo se tomaron –40 gramos de suelo en un tubo Falcon de 50 mililitros; esta muestra se secó por una semana, exponiendo el tubo al aire a temperatura ambiente, y posteriormente se pasó por un tamiz de 1 milímetro para eliminar material grueso del suelo. Las muestras homogeneizadas se almacenaron a 4°C hasta su empleo. Este tipo de muestreo por parcela se ha reportado previamente en diversos trabajos donde se han realizado monitoreos de comunidades microbianas empleando métodos masivos de identificación molecular y aislamiento de microorganismos cultivables y es una metodología previamente estandarizada en el laboratorio.

Durante el muestreo se tomó una submuestra de 100 gramos para realizar un análisis completo del suelo (nutrientes, pH, materia orgánica, textura); y una submuestra para preparar una suspensión para el aislamiento de los microorganismos.

Purificación de los microorganismos de la rizósfera y generación del banco de germoplasma vivo

Se empleó el método de diluciones seriales de la suspensión de suelo empleando cuatro tipos de medio:
•    Medio líquido para favorecer el crecimiento de Bacillus.
•    Medio de B de King para intentar el aislamiento de Pseudomonas.
•    Actinomyces Isolate Agar para Streptomyces.
•    Medio MRS para bacterias acidolácticas.

Todo esto se realizó con la finalidad de localizar poblaciones específicas de algunos grupos bacterianos importantes para el control biológico. Las diluciones seriales de –1 a –8 se colocaron a crecer a temperatura ambiente (de 25 a 30°C) por 24 horas. En el caso del medio para aislar Streptomyces, los medios con las diluciones seriales más bajas se dejaron crecer por tiempos más largos (de 5 a 7 días) para permitir el crecimiento de este tipo de bacterias filamentosas. Los microorganismos que crecieron en el transcurso de este tiempo fueron resembrados hasta lograr su total purificación. Los microorganismos purificados fueron colocados a crecer en medio líquido en placas de formato de 96 pozos de dos mililitros por 18 horas a 25°C, conteniendo 1 mililitro de medio. De esta suspensión de bacterias se tomaron 98 microlitros y se depositaron en cajas de 96 pozos de 200 microlitros, las cuales contenían 42 microlitros de Glicerol al 50%, para un volumen final de 140 microlitros de medio líquido en Glicerol, 15% por muestra. Las placas se crio-preservaron a –70°C.

En total se colocaron 120 cajas de 96 muestras cada una para dar un total de una colección de 11 mil 520 bacterias aisladas del suelo de maíz. Inicialmente se contempló obtener 10 mil microorganismos aislados del suelo de maíz, pero por previa experiencia de manejo de esta metodología de preservación en el laboratorio se prevé que cerca del 10% de los microorganismos que son congelados no logran sobrevivir al tratamiento, por lo que se optó por colocar al menos 10% más de 10 mil especímenes. Esta es la razón por la que se prevé una colección con 11 mil 520 microorganismos. Esta colección está almacenada por triplicado en diferentes ultracongeladores en las instalaciones del CIIDIR-Sinaloa, fue registrada ante el Instituto Politécnico Nacional en junio de 2009 y se denomina colección científica CIIDIR-002.

Identificación molecular del banco de germoplasma

Al total de las muestras que conforman el banco de germoplasma se les realizará la extracción de DNA genómico, por medio del kit DNeasy® Blood & Tissue Kit (siguiendo las recomendaciones del proveedor) y con la ayuda de la plataforma automatizada Qiacube (Qiagen). El ADN genómico será empleado para la identificación molecular posterior, mediante PCR. Se emplearán oligonucleótidos dirigidos a la amplificación de la región 16S del ADN ribosomal. Con esta finalidad se utilizarán los oligonucleótidos F2C (5’AGAGTTTGATCATGGCTC-3′) y C (5′-ACGGGCGGTGTGTAC-3′) que se ubican respectivamente en las posiciones de 8 a 25 y de mil 392 a mil 406 de la secuencia del 16S rDNA de Escherichia coli.
A la fecha se ha obtenido el DNA genómico de 2 mil 880 aislados bacterianos, y se han estandarizado las técnicas de PCR y purificación del producto de PCR, y se diseña y estudia la estrategia de secuenciación masiva adecuada que se seguirá para identificar a todos los aislados del banco.estrategiadecontrolbiologicodefusariumenmaiz-2

Monitoreo masivo de microorganismos con potencial antagonista a Fusarium (trabajo en desarrollo)

Los bioensayos in vitro automatizados se encuentran en etapa de montaje en la actualidad: La metodología que proponemos utilizar se describe brevemente a continuación. Se toma una alícuota de microorganismos del banco de germoplasma en formato de 96, en placas para PCR con solapa (skirted) de 0.2 mililitro, y se transfiere a una placa de 2 mililitros con formato de 96 conteniendo 1 mililitro de medio de cultivo PDA líquido. Esta placa se coloca a crecer por 18 horas a 25°C, con agitación de 200 repeticiones por minuto y después se coloca una suspensión de 1×106 microconidios de una cepa de Fusarium caracterizada como altamente patogénica en semillas de maíz en cada pozo de la placa de 96. La mezcla de microorganismos del banco con el patógeno se coloca a crecer a 25°C de 48 a 72 horas para analizar el efecto de la bacteria antagonista sobre la cepa de Fusarium.

El resultado del crecimiento conjunto de la bacteria y el hongo se centrifuga y se coloca en una placa óptica adicionando un anticuerpo de la aglutinina del germen de trigo (WGA, por sus siglas en inglés) que se une específicamente a las paredes de quitina del hongo. Este anticuerpo se encuentra químicamente acoplado al fluoróforo Alexa-Fluor 488 nanómetros, que puede ser cuantificado por el lector multimodal DTX880, de acuerdo a una curva estándar de fluorescencia realizada con el fluoróforo.

La fluorescencia se evalúa con respecto a controles conteniendo el hongo cultivado solo, y la disminución en la fluorescencia con respecto al control es un indicativo del efecto antagonista de los aislados sobre el crecimiento del hongo. De manera relativa, se estiman las unidades de fluorescencia del control sin antagonista, el porcentaje de inhibición de Fusarium y se seleccionan los microorganismos que causen una disminución de al menos el 30% de crecimiento del fitopatógeno.

El análisis masivo nos permitirá en un futuro breve trabajar con un subgrupo de organismos que muestren potencial antagonista en este bioensayo in vitro a Fusarium. Posteriormente, se realizarán bioensayos de antagonismo in vitro microorganismo contra microorganismo y microorganismo contra plántula.

Identificación de aislados patogénicos de Fusarium

De las muestras de plantas tomadas para la creación del banco se pusieron pedazos de  material vegetal (raíces y tallos) para crecer, aislar y verificar la presencia de Fusarium en las plantas enfermas. De manera adicional, en los laboratorios de los colaboradores del proyecto (Miguel Apodaca Sánchez, integrante de la Universidad Autónoma de Sinaloa y Rubén Félix Gastélum, miembro de la Universidad de Occidente y de la Junta de Sanidad Vegetal de Ahome) se evalúan algunos aislados de muestras desde un punto de vista morfológico. Estas muestras fueron recolectadas de diferentes sitios de Sinaloa, en la Junta Local de Sanidad Vegetal de Ahome y en Juan José Ríos.

Las pruebas de patogenicidad del hongo Fusarium en maíz blanco y amarillo se analizan al comparar el aspecto fisiológico de plántulas de maíz de dos semanas pos-inoculación (tres semanas a la pos-emergencia) tratadas con cada aislado, de acuerdo a una escala de severidad, y se le asigna un valor con base en esta escala. El valor 1 corresponde al control no tratado o a aquellos aislados de Fusarium que no muestran ninguna sintomatología, el máximo grado que se establece en la escala que es de 5, y básicamente corresponden a la muerte de la planta.

De los ensayos realizados con diferentes aislados de Fusarium se han seleccionado tres aislados (A, B y C), con patogenicidad 5 en la escala de severidad. Para la siguiente etapa del proyecto, se estudia la posibilidad de enfrentar con una sola cepa de Fusarium, o bien trabajar con una mezcla de las tres distintas cepas de Fusarium con mayor patogenicidad.
Adicionalmente a este trabajo y en colaboración con los grupos de Apodaca Sánchez y de Félix Gastélum se ha desarrollado un banco, o colección de 122 aislados de Fusarium provenientes de maíz preservados por congelación a –70°C. Estos aislados serán
analizados en cuando a su patogenicidad e identificados tanto a nivel morfológico como molecular. Esto se hace porque aun cuando existen reportes de que el hongo que produce esta sintomatología es Fusarium, no se tiene la certeza de cuál especie es la que está afectando al cultivo, finalidad que tiene este proyecto: busca contribuir a identificar molecular y morfológicamente cuál es la especie de Fusarium que causa la pudrición del tallo y raíz en el maíz en Sinaloa.

Bioensayos en planta a nivel maceta (trabajo a futuro)

Una vez analizados los resultados de los bioensayos in vitro se seleccionarán los mejores aislados (de 10 a 100) para realizar pruebas en planta a nivel maceta en charolas de germinación. Los tratamientos se realizarán al menos por quintuplicado.

El experimento consistirá en los siguientes tratamientos: control de germinación (semilla más sustrato más Fusarium), control del efecto del antagonista sobre las plantas (semilla más antagonista) y tratamientos de bioprotección (semilla más antagonista más Fusarium más sustrato).

Se emplearán semillas de maíz blanco, que se desinfectarán superficialmente (tratamiento químico/hidrotérmico) y, posteriormente, se embeberán por dos horas en las suspensiones bacterianas seleccionadas, que serán llevadas de 1 “OD” (‘densidad de óptica’) a 485 nanómetros. Asimismo, se embeberán semillas en agua para los tratamientos sin antagonistas. Para la germinación, se utilizarán vasos de unicel de 500 mililitros, que contendrán una mezcla de sustrato-tierra estéril (1:1, volumen por volumen). En cada vaso se germinarán dos semillas. Siete días después de la germinación se inocularán de nuevo en la base del tallo de las plántulas, con 2 mililitros de la suspensión bacteriana correspondiente, a la misma concentración de 1 OD a 485 nanómetros.

Catorce días después de la germinación se inoculará la base del tallo con una suspensión de microconidios de Fusarium, a 1 x 106 por mililitro. La cepa patogénica de Fusarium utilizada será corroborada en su patogenicidad y agresividad en maíz, seleccionando aquella que resulte más patogénica, y se mantendrá en placas de medio agua-agar de donde se resembrará a cajas con medio de PDA y se dejará de crecer por dos semanas; transcurrido este tiempo, y con la ayuda de una varilla de vidrio y agua destilada estéril, se preparará una suspensión de microconidios. Para conocer la cantidad de microconidios por mililitro se utilizará una cámara de Neubauer y se contarán tres alícuotas.

Los experimentos se mantendrán en una cámara de crecimiento, a una temperatura de 25 por 20°C y un fotoperiodo de 16 horas luz por ocho horas oscuridad, de 45 a 60 días. Dependiendo de los resultados obtenidos en estas pruebas se seleccionarán aquellos antagonistas con posibilidades de ser empleados en pruebas de campo.

Conclusiones

Hasta septiembre de 2009 se montó un laboratorio dedicado a la búsqueda de antagonistas bacterianos a Fusarium spp y se ha desarrollado una colección de 11 mil 520 microorganismos del suelo asociados a maíz y nativos de Sinaloa. Esta colección será identificada molecularmente en su totalidad, para lo que ya se cuenta con la estandarización de las técnicas para la identificación molecular; se han procesado 2 mil 880 microorganismos del banco en la primera fase de identificación molecular, lo que implica la extracción de su ADN genómico.

En cuanto a la identificación de antagonistas de esta colección de bacterias se han obtenido, con la colaboración de otros grupos en el estado de Sinaloa, la obtención de cepas patogénicas de Fusarium de maíz y se trabaja en la estanda-rización de las pruebas de patogenicidad de los aislados de Fusarium spp in vitro. Actualmente se trabaja en el desarrollo de la metodología de escrutinio masivo de antagonismo a Fusarium que permita identificar rápidamente organismos potenciales para continuar en etapas subsiguientes para desarrollar una estrategia de control biológico de Fusarium en maíz.

Este proyecto abrirá la posibilidad del uso de esta colección de microorganismos como una nueva herramienta para el monitoreo de antagonistas a otros patógenos del cultivo de maíz y de otros cultivos de importancia comercial para Sinaloa.

En el futuro, los resultados del proyecto permitirán el escrutinio y desarrollo de nuevas y más rápidas estrategias de control biológico empleando organismos nativos de nuestros suelos, con lo que se brindará una respuesta más oportuna a los productores de Sinaloa ante las distintas problemáticas de fitosanidad que pudieran presentarse.  AS

Jesús D. Cordero Ramírez, Ignacio E. Maldonado Mendoza, Centro Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo Integral Regional, Unidad Sinaloa